Ubiquitin (유비퀴틴)은 아미노산 76개로 이루어진 단백질이다. 이들은 분해하고자 하는 타겟 단백질에 붙게 되고, 이를 Proteasome (프로테아좀)이 인식하여 Degradation 된다. 이러한 단백질분해표지 기능 외에도 endocytosis, 세포신호전달 등에 관여한다고 알려져있다. 타겟 단백질이 분해되기위해 polyubiquitin이 형성되어야 한다. Polyubiquitin은 기질 (타겟 단백질)에 붙은 유비퀴틴에 존재하는 Lysine (라이신, K)에 다른 유비퀴틴의 Glycine (글라이신, G)이 연결된다. 이때, 어떤 라이신 잔기에 유비퀴틴이 붙느냐에 따라 역할이 달라진다. 48번째 K( K48)에 붙을 경우 단백질 분해가 일어나며, 63번째 K (K63)에 붙을 경우 endoc..
MTT assay - MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)란 시약을 통해 세포의 cell viability를 측정하는 방법이다. 이 시약은 빛에 약해 dark condition에서 보관하여야 하며, assay를 진행할 때에도 dark condition에서 진행한다. MTT reagent는 노란색을 띄고 있으나 살아있는 세포와 만나게 되면, 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 tetrazolium의 ring 구조가 끊어지면서 청자색을 띠는 비수용성의 MTT formazan 결정으로 환원된다. 이후 유기용매인 DMSO를 이용해 formazan을 녹여 흡광도 측정을 통해 상대적인 cell viability를 측정할 수..
Transfection - 세포에 DNA or siRNA transfection를 통해 어떠한 유전자를 Overexpression(O/E) 또는 Knockdown(KD) 시키는 것을 말한다. Transfection에는 Electroporation을 이용한 물리적 방법과 Lipofectamine과 같은 reagent를 이용한 화학적 방법이 있다. 여기서는 화학적 방법을 이용한 Transfection을 설명한다. 다음 내용은 참고로 알아두면 좋다. 유전자를 세포에 주입하는 것을 Transfection이라 하며, 박테리아에 주입하는 것을 Transformation, 세포에 viral을 통해 주입하는 것을 Transduction이라 한다. 1. 사전에 7-80% confluency로 cell을 seeding 한..
Virus infection - 미지의 단백질을 KO 또는 O/E 하는 유전체를 내포하는 바이러스를 세포에 infection 하여 세포의 transduction을 유도하기 위함이다. 1. 사전에 Cell confluency가 70%가 되도록 cell을 seeding 한다. 2. Virus와 culture media의 비율은 1:1이며, 원활한 infection을 위해 polybrene을 5ug/ml의 농도로 넣어준다. 3. 37℃·24hr incubation 수행 후 media를 제거한다. 4. Selection을 위하여 항생제를 넣어준 후 37℃·48hr incubation 한다. 5. Western blotting을 통해 해당 단백질의 KO 또는 O/E 여부를 확인한다.
Lentivirus production - 미지의 단백질을 KO 또는 O/E를 유도하는 viral을 생산하여 세포주에 transduction 시키기 위함. Lentivirus를 만들기 위해 plasmid vector (PLP1, PLP2, VSV-G)가 필요하다. 293FT 세포주를 사용하였으며 PEI를 이용한 transfection을 통해 렌티바이러스를 생산하였다. 1. Sample 당 PLP1, 2 (1.5ug) VSV-G (3ug), target Protein plasmid (2ug)이 필요하다. 2. 각각의 plasmid의 양을 참고하여 EP tube에 넣어주고, Opti-MEM 500ul을 넣어 suspension 한다. 3. Sample 당 PEI 24ul, Opti-MEM 500ul이 필요하..
Midi-prep - DNA와 plasmid의 형태구조 차이를 이용하여 원하는 Plasmid DNA를 정제하기 위함이다. 정제하고자 하는 plasmid DNA는 사전에 박테리아에 transformation 되어 배양되었다. plasmid DNA를 정제하기 위해 해당 글에선 Qiagen의 Kit (12943)를 사용하였다. 사전에 transformation 된 박테리아는 100ml의 media에 배양되어졌다. 1. 배양된 박테리아를 4℃·6000xg·15min 조건에서 centrifuge를 수행한다. (만약 이들을 보관하고자 한다면 상층액은 버리고 pellet만을 -70℃에 보관한다.) 2. 상층액은 버리고 pellet이 딸려가지 않게끔 조심한다. 3. Kit에 포함된 P1 buffer을 4ml 넣고 볼텍..
Single colony isolation - LB agar plate에서 배양되어 single colony 형성한 박테리아를 selection 하기 위함이다. 이후 이들 colony는 대량생산 하고자 하는 plasmid를 prep 하기 위해 배양되어진다. 1. LB agar plate에 형성된 single colony를 멸균 팁을 이용하여 colony만을 따낸다. 이때, 확실하게 colony를 따기 위해서 agar 배지까지 같이 따는게 좋다. 2. colony가 따진 팁을 5ml의 LB media가 들어있는 tube에 팁 전체를 넣는다. 이때, 파이펫팅을 통해 팁에 묻은 colony를 전부 풀어준다는 느낌으로 수행한다. 3. tube의 뚜껑을 닫아주나 꽉 닫지 않고 살짝 풀어준다. 4. Shaking ..
LB agar plate - Transformation 된 E.coli를 배양하여 single-colony를 얻기위함이다. 1. 1L 삼각 플라스크에 마그네틱 바를 넣어준 뒤, 3차 증류수 500ml 가량을 넣는다. 2. 삼각 플라스크에 LB broth 25g 넣고 호일로 입구를 감싼 뒤, 교반기에서 LB broth가 녹을 때까지 mixing 한다. 3. LB broth가 다 녹으면 3차 증류수를 넣어 1L를 맞추어준다. 4. 3번의 LB media 500ml를 다른 bottle로 옮긴 후 7.5g의 agar를 넣어주고 autoclave를 수행한다. (남은 500ml의 LB media는 추후 박테리아 배양에 사용한다.) 5. Autoclave가 끝난 LB agar media를 교반기에서 식혀준다. (교반..
Transformation - 원하는 유전자가 삽입된 plasmid vector를 박테리아에 도입하는 것을 말한다. 이러한 박테리아를 competent cell이라고 부르며, 주로 투과성이 좋은 세포벽을 가진 E.coli를 사용한다. 이 후에는 형질전환 된 박테리아를 대량배양하여 추후 원하는 유전자가 삽입된 plasmid vector만을 대량 얻어낼 수 있다. 1. 사전에 water bath를 42℃로 맞추어 둔다. (Heat shock을 위함.) 2. plasmid와 competent cell을 꺼내어 ice에 박은 상태로 녹여준다. 3. plasmid 0.5ul과 competent cell 100ul을 넣어 파이펫팅으로 섞어준다. 4. 3번의 sample을 ice에서 3-40분 가량 incubatio..
모든 실험과정의 sample은 ice에 두어 수행하며, 단백질은 사전에 정량해둔다. 또한, pre-clearing 및 IP 과정에 앞서 Input으로 사용될 lysate를 사전에 tube에 옮겨둔다. Sample #1 Pre-clearing - control 항체 및 bead 등에 non-specific binding protein을 제거하기 위함이며, 일반적으로 pre-clearing 과정 없이 진행한 IP에서 WB 결과 background가 잡힐 경우 진행한다. 1. Lysate에 control 항체 (lysate 1mg당 1ul) 또는 bead (lysate 1ml 당 50ul)을 넣은 후, shaking rotor에서 4℃·1hr incubation 한다. 2. 2500xg·4℃·3min cent..
Biology/background 2021. 1. 19. 14:09
Ubiquitin (유비퀴틴)은 아미노산 76개로 이루어진 단백질이다. 이들은 분해하고자 하는 타겟 단백질에 붙게 되고, 이를 Proteasome (프로테아좀)이 인식하여 Degradation 된다. 이러한 단백질분해표지 기능 외에도 endocytosis, 세포신호전달 등에 관여한다고 알려져있다. 타겟 단백질이 분해되기위해 polyubiquitin이 형성되어야 한다. Polyubiquitin은 기질 (타겟 단백질)에 붙은 유비퀴틴에 존재하는 Lysine (라이신, K)에 다른 유비퀴틴의 Glycine (글라이신, G)이 연결된다. 이때, 어떤 라이신 잔기에 유비퀴틴이 붙느냐에 따라 역할이 달라진다. 48번째 K( K48)에 붙을 경우 단백질 분해가 일어나며, 63번째 K (K63)에 붙을 경우 endoc..
Biology/protocol 2021. 1. 18. 17:08
MTT assay - MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)란 시약을 통해 세포의 cell viability를 측정하는 방법이다. 이 시약은 빛에 약해 dark condition에서 보관하여야 하며, assay를 진행할 때에도 dark condition에서 진행한다. MTT reagent는 노란색을 띄고 있으나 살아있는 세포와 만나게 되면, 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 tetrazolium의 ring 구조가 끊어지면서 청자색을 띠는 비수용성의 MTT formazan 결정으로 환원된다. 이후 유기용매인 DMSO를 이용해 formazan을 녹여 흡광도 측정을 통해 상대적인 cell viability를 측정할 수..
Biology/protocol 2021. 1. 18. 16:34
Transfection - 세포에 DNA or siRNA transfection를 통해 어떠한 유전자를 Overexpression(O/E) 또는 Knockdown(KD) 시키는 것을 말한다. Transfection에는 Electroporation을 이용한 물리적 방법과 Lipofectamine과 같은 reagent를 이용한 화학적 방법이 있다. 여기서는 화학적 방법을 이용한 Transfection을 설명한다. 다음 내용은 참고로 알아두면 좋다. 유전자를 세포에 주입하는 것을 Transfection이라 하며, 박테리아에 주입하는 것을 Transformation, 세포에 viral을 통해 주입하는 것을 Transduction이라 한다. 1. 사전에 7-80% confluency로 cell을 seeding 한..
Biology/protocol 2021. 1. 11. 19:32
Virus infection - 미지의 단백질을 KO 또는 O/E 하는 유전체를 내포하는 바이러스를 세포에 infection 하여 세포의 transduction을 유도하기 위함이다. 1. 사전에 Cell confluency가 70%가 되도록 cell을 seeding 한다. 2. Virus와 culture media의 비율은 1:1이며, 원활한 infection을 위해 polybrene을 5ug/ml의 농도로 넣어준다. 3. 37℃·24hr incubation 수행 후 media를 제거한다. 4. Selection을 위하여 항생제를 넣어준 후 37℃·48hr incubation 한다. 5. Western blotting을 통해 해당 단백질의 KO 또는 O/E 여부를 확인한다.
Biology/protocol 2021. 1. 11. 19:17
Lentivirus production - 미지의 단백질을 KO 또는 O/E를 유도하는 viral을 생산하여 세포주에 transduction 시키기 위함. Lentivirus를 만들기 위해 plasmid vector (PLP1, PLP2, VSV-G)가 필요하다. 293FT 세포주를 사용하였으며 PEI를 이용한 transfection을 통해 렌티바이러스를 생산하였다. 1. Sample 당 PLP1, 2 (1.5ug) VSV-G (3ug), target Protein plasmid (2ug)이 필요하다. 2. 각각의 plasmid의 양을 참고하여 EP tube에 넣어주고, Opti-MEM 500ul을 넣어 suspension 한다. 3. Sample 당 PEI 24ul, Opti-MEM 500ul이 필요하..
Biology/protocol 2021. 1. 11. 16:17
Midi-prep - DNA와 plasmid의 형태구조 차이를 이용하여 원하는 Plasmid DNA를 정제하기 위함이다. 정제하고자 하는 plasmid DNA는 사전에 박테리아에 transformation 되어 배양되었다. plasmid DNA를 정제하기 위해 해당 글에선 Qiagen의 Kit (12943)를 사용하였다. 사전에 transformation 된 박테리아는 100ml의 media에 배양되어졌다. 1. 배양된 박테리아를 4℃·6000xg·15min 조건에서 centrifuge를 수행한다. (만약 이들을 보관하고자 한다면 상층액은 버리고 pellet만을 -70℃에 보관한다.) 2. 상층액은 버리고 pellet이 딸려가지 않게끔 조심한다. 3. Kit에 포함된 P1 buffer을 4ml 넣고 볼텍..
Biology/protocol 2021. 1. 8. 13:41
Single colony isolation - LB agar plate에서 배양되어 single colony 형성한 박테리아를 selection 하기 위함이다. 이후 이들 colony는 대량생산 하고자 하는 plasmid를 prep 하기 위해 배양되어진다. 1. LB agar plate에 형성된 single colony를 멸균 팁을 이용하여 colony만을 따낸다. 이때, 확실하게 colony를 따기 위해서 agar 배지까지 같이 따는게 좋다. 2. colony가 따진 팁을 5ml의 LB media가 들어있는 tube에 팁 전체를 넣는다. 이때, 파이펫팅을 통해 팁에 묻은 colony를 전부 풀어준다는 느낌으로 수행한다. 3. tube의 뚜껑을 닫아주나 꽉 닫지 않고 살짝 풀어준다. 4. Shaking ..
Biology/protocol 2021. 1. 6. 18:52
LB agar plate - Transformation 된 E.coli를 배양하여 single-colony를 얻기위함이다. 1. 1L 삼각 플라스크에 마그네틱 바를 넣어준 뒤, 3차 증류수 500ml 가량을 넣는다. 2. 삼각 플라스크에 LB broth 25g 넣고 호일로 입구를 감싼 뒤, 교반기에서 LB broth가 녹을 때까지 mixing 한다. 3. LB broth가 다 녹으면 3차 증류수를 넣어 1L를 맞추어준다. 4. 3번의 LB media 500ml를 다른 bottle로 옮긴 후 7.5g의 agar를 넣어주고 autoclave를 수행한다. (남은 500ml의 LB media는 추후 박테리아 배양에 사용한다.) 5. Autoclave가 끝난 LB agar media를 교반기에서 식혀준다. (교반..
Biology/protocol 2021. 1. 6. 17:55
Transformation - 원하는 유전자가 삽입된 plasmid vector를 박테리아에 도입하는 것을 말한다. 이러한 박테리아를 competent cell이라고 부르며, 주로 투과성이 좋은 세포벽을 가진 E.coli를 사용한다. 이 후에는 형질전환 된 박테리아를 대량배양하여 추후 원하는 유전자가 삽입된 plasmid vector만을 대량 얻어낼 수 있다. 1. 사전에 water bath를 42℃로 맞추어 둔다. (Heat shock을 위함.) 2. plasmid와 competent cell을 꺼내어 ice에 박은 상태로 녹여준다. 3. plasmid 0.5ul과 competent cell 100ul을 넣어 파이펫팅으로 섞어준다. 4. 3번의 sample을 ice에서 3-40분 가량 incubatio..
Biology/protocol 2021. 1. 5. 13:14
모든 실험과정의 sample은 ice에 두어 수행하며, 단백질은 사전에 정량해둔다. 또한, pre-clearing 및 IP 과정에 앞서 Input으로 사용될 lysate를 사전에 tube에 옮겨둔다. Sample #1 Pre-clearing - control 항체 및 bead 등에 non-specific binding protein을 제거하기 위함이며, 일반적으로 pre-clearing 과정 없이 진행한 IP에서 WB 결과 background가 잡힐 경우 진행한다. 1. Lysate에 control 항체 (lysate 1mg당 1ul) 또는 bead (lysate 1ml 당 50ul)을 넣은 후, shaking rotor에서 4℃·1hr incubation 한다. 2. 2500xg·4℃·3min cent..