- DNA와 plasmid의 형태구조 차이를 이용하여 원하는 Plasmid DNA를 정제하기 위함이다. 정제하고자 하는 plasmid DNA는사전에박테리아에 transformation 되어 배양되었다. plasmid DNA를 정제하기 위해 해당 글에선 Qiagen의 Kit (12943)를 사용하였다.
사전에 transformation 된 박테리아는 100ml의 media에 배양되어졌다.
1.배양된 박테리아를 4℃·6000xg·15min 조건에서 centrifuge를 수행한다.
(만약 이들을 보관하고자 한다면 상층액은 버리고 pellet만을 -70℃에 보관한다.)
2.상층액은 버리고 pellet이 딸려가지 않게끔 조심한다.
3.Kit에 포함된 P1 buffer을 4ml 넣고 볼텍싱을 통해 pellet을 풀어준다.
4.3번 과정의 용액을 50ml tube에 transfer하고, P2 buffer 4ml을 넣고 4-6회 Inverting 해준다.
그리고 RT에서 3min간 incubation 한다. (5분을 넘기지 않는다.)
(볼텍싱 시 plasmid DNA가 손상될 수 있으며, P2 buffer를 넣으면 용해물에 점성이 생긴다.)
5.4번 과정의 용액에 S3 buffer 4ml을 넣고 4-6회 Inverting 해준다.
6.vacuum 장치를 연결하고 5번 과정의 용액을 cartridge filter 안에 부어 RT에서 10min incubation 한다.
(이때,cartridge filter는 50ml 튜브에 넣어져있어야 한다.)
7.cartridge filter를 Plunger를 넣어 용액을 천천히 밀어내어 debris들을 걸러준다.
11.spin column에 PE buffer 700ul을 넣고, vacuum 장치를 작동시킨다.
12.기존에spin column에 꽂혀있던 플라스틱을 다시 연결한 후 RT, 9700rpm, 1min 조건에서 centrifuge를 수행한다.
13.spin column을 1.5ml tube에 꽂고 EB buffer 200ul을 넣어 1분간 RT에서 incubation 한다.
14.이후 RT, 9700rpm, 1min 조건에서 centrifuge를 수행한다.
15.260nm와 280nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정제된 plasmid DNA purity를 측정한다.
*P1 buffer (Resuspension buffer): 세포벽을 파괴하고 RNA 분해를 촉진한다. glucose는 삼투압 유지, Tris-HCl은 pH유지, EDTA는 킬레이트로써 세포벽에 있는 이온들을 제거하여 세포벽 파괴가 용이하게끔 한다. 더불어 RNase는 RNA를 파괴하여 plasmid DNA 채취가 쉽도록 한다. 2-8℃에 보관하여 RNase의 활성화를 방지한다.
*P2 buffer (Lysis buffer): Alkaline lysis와 세포막 분해, DNA&RNA 변성, 단백질 제거를 담당한다. NaOH는 높은 pH를 유도하여 plasmid DNA와 유전체 DNA를 모두 변성시킨다. SDS는 계면활성제로써 인지질을 갖는 세포막을 완전히 분해시키고, 다른 단백질도 변성시켜 plasmid DNA 채취를 용이하게끔 한다.
*P3 buffer (Neutralization buffer): Lysis buffer 때문에 높아진 pH를 다시 중성으로 내려 변성되었던 plasmid DNA가 제모양으로 돌아오게 된다. DNA는 변성되어 꼬이고 단백질도 뒤엉켜 원상태로 돌아오지 못하게 된다.
*ETR&PE buffer: 남아있는 염들을 씻어내고 DNA 순도를 높여준다.(Wash 과정)
Midi-prep
Midi-prep
- DNA와 plasmid의 형태구조 차이를 이용하여 원하는 Plasmid DNA를 정제하기 위함이다. 정제하고자 하는 plasmid DNA는 사전에 박테리아에 transformation 되어 배양되었다. plasmid DNA를 정제하기 위해 해당 글에선 Qiagen의 Kit (12943)를 사용하였다.
사전에 transformation 된 박테리아는 100ml의 media에 배양되어졌다.
1. 배양된 박테리아를 4℃·6000xg·15min 조건에서 centrifuge를 수행한다.
(만약 이들을 보관하고자 한다면 상층액은 버리고 pellet만을 -70℃에 보관한다.)
2. 상층액은 버리고 pellet이 딸려가지 않게끔 조심한다.
3. Kit에 포함된 P1 buffer을 4ml 넣고 볼텍싱을 통해 pellet을 풀어준다.
4. 3번 과정의 용액을 50ml tube에 transfer하고, P2 buffer 4ml을 넣고 4-6회 Inverting 해준다.
그리고 RT에서 3min간 incubation 한다. (5분을 넘기지 않는다.)
(볼텍싱 시 plasmid DNA가 손상될 수 있으며, P2 buffer를 넣으면 용해물에 점성이 생긴다.)
5. 4번 과정의 용액에 S3 buffer 4ml을 넣고 4-6회 Inverting 해준다.
6. vacuum 장치를 연결하고 5번 과정의 용액을 cartridge filter 안에 부어 RT에서 10min incubation 한다.
(이때, cartridge filter는 50ml 튜브에 넣어져있어야 한다.)
7. cartridge filter를 Plunger를 넣어 용액을 천천히 밀어내어 debris들을 걸러준다.
8. debris가 걸러진 50ml tube의 용액에 Binding buffer 2ml을 넣어주고, 4-6회 inverting 해준다.
(알칼리 용해 후 올바른 바인딩 조건 조성)
9. vacuum 장치에 spin column을 꽂고 그 위에 Extender를 꽂는다. 그리고 Extendr에 8번 sample을 넣고 vacuum 장치를 작동시켜 컬럼을 통해 용액이 빠져나가게끔 한다.
10. Extendr를 빼고 spin column에 ETR buffer 700ul을 넣고, vacuum 장치를 작동시킨다.
11. spin column에 PE buffer 700ul을 넣고, vacuum 장치를 작동시킨다.
12. 기존에 spin column에 꽂혀있던 플라스틱을 다시 연결한 후 RT, 9700rpm, 1min 조건에서 centrifuge를 수행한다.
13. spin column을 1.5ml tube에 꽂고 EB buffer 200ul을 넣어 1분간 RT에서 incubation 한다.
14. 이후 RT, 9700rpm, 1min 조건에서 centrifuge를 수행한다.
15. 260nm와 280nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정제된 plasmid DNA purity를 측정한다.
*P1 buffer (Resuspension buffer): 세포벽을 파괴하고 RNA 분해를 촉진한다. glucose는 삼투압 유지, Tris-HCl은 pH유지, EDTA는 킬레이트로써 세포벽에 있는 이온들을 제거하여 세포벽 파괴가 용이하게끔 한다. 더불어 RNase는 RNA를 파괴하여 plasmid DNA 채취가 쉽도록 한다. 2-8℃에 보관하여 RNase의 활성화를 방지한다.
*P2 buffer (Lysis buffer): Alkaline lysis와 세포막 분해, DNA&RNA 변성, 단백질 제거를 담당한다. NaOH는 높은 pH를 유도하여 plasmid DNA와 유전체 DNA를 모두 변성시킨다. SDS는 계면활성제로써 인지질을 갖는 세포막을 완전히 분해시키고, 다른 단백질도 변성시켜 plasmid DNA 채취를 용이하게끔 한다.
*P3 buffer (Neutralization buffer): Lysis buffer 때문에 높아진 pH를 다시 중성으로 내려 변성되었던 plasmid DNA가 제모양으로 돌아오게 된다. DNA는 변성되어 꼬이고 단백질도 뒤엉켜 원상태로 돌아오지 못하게 된다.
*ETR&PE buffer: 남아있는 염들을 씻어내고 DNA 순도를 높여준다. (Wash 과정)
*EB buffer: column의 membrane에 붙어있는 plasmid DNA를 녹여 분리한다. (Elution 과정)
- purity는 1.8~2.0 사이가 적절하며 260과 280nm 파장에서 측정 후 두 측정 값을 다음과 같이 나누어 순도를 계산한다. (260/280nm)
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