- 원하는 유전자가 삽입된 plasmid vector를 박테리아에 도입하는 것을 말한다. 이러한 박테리아를 competent cell이라고 부르며, 주로 투과성이 좋은 세포벽을 가진 E.coli를 사용한다. 이 후에는 형질전환 된 박테리아를 대량배양하여 추후 원하는 유전자가 삽입된 plasmid vector만을 대량 얻어낼 수 있다.
1. 사전에 water bath를 42℃로 맞추어 둔다. (Heat shock을 위함.)
2. plasmid와 competent cell을 꺼내어 ice에 박은 상태로 녹여준다.
3. plasmid 0.5ul과 competent cell 100ul을 넣어 파이펫팅으로 섞어준다.
4. 3번의 sample을 ice에서 3-40분 가량 incubation 한다.
5.42℃의 water bath에서 1분 동안 heat shock을 주며, heat shock이 끝난 후에는 바로 ice에 5분간 둔다.
7. 6번의 sample을 8000rpm·30sec 조건으로 down 시켜 pellet을 얻어낸다.
8. 7번의 sample에서 sup 550ul만을 따서 버린 후, 남은 50ul의 sup으로 pellet을 suspension 한다.
9. 8번의 sample을 plasmid의 selection marker가 포함된 Agar 배지 plate에 spreading 한다.
(항생제가 포함된 배지에서 배양해야 정상적으로 plasmid가 도입된 박테리아만을 키울 수 있다.)
10. plate를 파라필름으로 감싼 후 뚜껑이 지면을 향하게 두어 37℃의 incubator에서 overnight incubation 한다. (Overnight는 12-16hr 정도를 말하며 single-colony를 얻어야하기에 너무 오랜 시간 incubation 하지 않는다.)
* single-colony는 동그랗고 반짝반짝 거리는 상태가 가장 좋다.
* spreading은 agar 배지가 찢어지지 않도록 하며, 3-4번에 걸쳐 spread 하여야 single-colony를 얻기 용이하다.
Transformation
Transformation
- 원하는 유전자가 삽입된 plasmid vector를 박테리아에 도입하는 것을 말한다. 이러한 박테리아를 competent cell이라고 부르며, 주로 투과성이 좋은 세포벽을 가진 E.coli를 사용한다. 이 후에는 형질전환 된 박테리아를 대량배양하여 추후 원하는 유전자가 삽입된 plasmid vector만을 대량 얻어낼 수 있다.
1. 사전에 water bath를 42℃로 맞추어 둔다. (Heat shock을 위함.)
2. plasmid와 competent cell을 꺼내어 ice에 박은 상태로 녹여준다.
3. plasmid 0.5ul과 competent cell 100ul을 넣어 파이펫팅으로 섞어준다.
4. 3번의 sample을 ice에서 3-40분 가량 incubation 한다.
5. 42℃의 water bath에서 1분 동안 heat shock을 주며, heat shock이 끝난 후에는 바로 ice에 5분간 둔다.
(heat shock을 통해 세포막의 투과성이 높아져 plasmid가 박테리아에 도입되고, ice에 박아줌으로써 세포막의 투과성이 낮아지게 된다.)
6. 5번의 sample에 배양배지를 500ul 넣어주고, 37℃의 shaking incubator에서 40분간 incubation 한다.
7. 6번의 sample을 8000rpm·30sec 조건으로 down 시켜 pellet을 얻어낸다.
8. 7번의 sample에서 sup 550ul만을 따서 버린 후, 남은 50ul의 sup으로 pellet을 suspension 한다.
9. 8번의 sample을 plasmid의 selection marker가 포함된 Agar 배지 plate에 spreading 한다.
(항생제가 포함된 배지에서 배양해야 정상적으로 plasmid가 도입된 박테리아만을 키울 수 있다.)
10. plate를 파라필름으로 감싼 후 뚜껑이 지면을 향하게 두어 37℃의 incubator에서 overnight incubation 한다. (Overnight는 12-16hr 정도를 말하며 single-colony를 얻어야하기에 너무 오랜 시간 incubation 하지 않는다.)
* single-colony는 동그랗고 반짝반짝 거리는 상태가 가장 좋다.
* spreading은 agar 배지가 찢어지지 않도록 하며, 3-4번에 걸쳐 spread 하여야 single-colony를 얻기 용이하다.
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