모든 실험과정의 sample은 ice에 두어 수행하며, 단백질은 사전에 정량해둔다.
또한, pre-clearing 및 IP 과정에 앞서 Input으로 사용될 lysate를 사전에 tube에 옮겨둔다. Sample #1
Pre-clearing
- control 항체 및 bead 등에 non-specific binding protein을 제거하기 위함이며, 일반적으로 pre-clearing 과정 없이 진행한 IP에서 WB 결과 background가 잡힐 경우 진행한다.
1. Lysate에 control 항체 (lysate 1mg당 1ul) 또는 bead (lysate 1ml 당 50ul)을 넣은 후, shaking rotor에서 4℃·1hr incubation 한다.
2. 2500xg·4℃·3min centrifuge 후 sup만을 새로운 tube에 transfer 한다.
(control 항체로 pre-clearing 시 bead를 넣어 추가 incubation 후 2번 step을 수행한다.)
Immunoprecipitation (IP)
- target protein과 binding 하는 미지의 protein을 collection하기 위함이다.
1. pre-clearing이 완료된 각각의 lysate에 각각 control 항체 및 traget protein 1차 항체를 넣은 후 4℃·overnight incubation 한다.
(lysate 1mg 당 1ul를 넣어도 IP가 수행되기도 하나 그렇지 않을 경우 항체 구매처의 datasheet를 따른다.)
2. 1번 step의 Lysate 각각에 protein A/G agarose bead (lysate 1ml 당 50ul)을 넣은 후, shaking rotor에서 4℃·1-4hr incubation 한다.
3. 6000rpm·30sec centrifuge 후 30sec 대기한다. 이후 발생된 sup은 keep해둔다. (IP 자체가 수행되지 않을 수 있기 때문임.) Sample #2
4. 항체 및 bead가 있는 sample에 NETN lysis buffer (W/O phosphatase·protease inhibitor) 1ml을 넣은 후 위아래로 흔들어준다.
이후 6000rpm·30sec centrifuge 후 30sec 대기한다. 이때 발생된 sup은 버린다. (Wash 과정)
5. 4번 과정을 4-5회 수행하며, 마지막 step의 sup은 최대한 제거한다.
6. 5번 step의 각 sample에 2X sample buffer 40ul을 넣은 후 boling 한다. (Elution 과정) Sample #3, 4
7. Western blot을 수행한다.
Sample #1_ Input
Sample #2_ Sup
Sample #3_ Control
Sample #4_ Target
Immunoprecipitation (IP)_면역침강법
모든 실험과정의 sample은 ice에 두어 수행하며, 단백질은 사전에 정량해둔다.
또한, pre-clearing 및 IP 과정에 앞서 Input으로 사용될 lysate를 사전에 tube에 옮겨둔다. Sample #1
Pre-clearing
- control 항체 및 bead 등에 non-specific binding protein을 제거하기 위함이며, 일반적으로 pre-clearing 과정 없이 진행한 IP에서 WB 결과 background가 잡힐 경우 진행한다.
1. Lysate에 control 항체 (lysate 1mg당 1ul) 또는 bead (lysate 1ml 당 50ul)을 넣은 후, shaking rotor에서 4℃·1hr incubation 한다.
2. 2500xg·4℃·3min centrifuge 후 sup만을 새로운 tube에 transfer 한다.
(control 항체로 pre-clearing 시 bead를 넣어 추가 incubation 후 2번 step을 수행한다.)
Immunoprecipitation (IP)
- target protein과 binding 하는 미지의 protein을 collection하기 위함이다.
1. pre-clearing이 완료된 각각의 lysate에 각각 control 항체 및 traget protein 1차 항체를 넣은 후 4℃·overnight incubation 한다.
(lysate 1mg 당 1ul를 넣어도 IP가 수행되기도 하나 그렇지 않을 경우 항체 구매처의 datasheet를 따른다.)
2. 1번 step의 Lysate 각각에 protein A/G agarose bead (lysate 1ml 당 50ul)을 넣은 후, shaking rotor에서 4℃·1-4hr incubation 한다.
3. 6000rpm·30sec centrifuge 후 30sec 대기한다. 이후 발생된 sup은 keep해둔다. (IP 자체가 수행되지 않을 수 있기 때문임.) Sample #2
4. 항체 및 bead가 있는 sample에 NETN lysis buffer (W/O phosphatase·protease inhibitor) 1ml을 넣은 후 위아래로 흔들어준다.
이후 6000rpm·30sec centrifuge 후 30sec 대기한다. 이때 발생된 sup은 버린다. (Wash 과정)
5. 4번 과정을 4-5회 수행하며, 마지막 step의 sup은 최대한 제거한다.
6. 5번 step의 각 sample에 2X sample buffer 40ul을 넣은 후 boling 한다. (Elution 과정) Sample #3, 4
7. Western blot을 수행한다.
Sample #1_ Input
Sample #2_ Sup
Sample #3_ Control
Sample #4_ Target
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