- 미지의 단백질을 KO 또는 O/E를 유도하는 viral을 생산하여 세포주에 transduction 시키기 위함. Lentivirus를 만들기 위해 plasmid vector (PLP1, PLP2, VSV-G)가 필요하다. 293FT 세포주를 사용하였으며 PEI를 이용한 transfection을 통해 렌티바이러스를 생산하였다.
1. Sample 당 PLP1, 2 (1.5ug) VSV-G (3ug), target Protein plasmid (2ug)이 필요하다.
2. 각각의 plasmid의 양을 참고하여 EP tube에 넣어주고, Opti-MEM 500ul을 넣어 suspension 한다.
3. Sample 당 PEI 24ul, Opti-MEM 500ul이 필요하다.
4. 각각의 sample 수만큼의 PEI와 Opti-MEM의 양을 계산하여 EP tube에 넣고 suspension 한다.
5. 2번과 4번 과정의 sample을 각각 RT·5min incubation 후 2번과 4번 과정을 mix 하여RT·20min incubation 한다.
6. 사전에 1.5x10^6 cells/60ø로 seeding 된 293FT 세포에 5번 과정의 sample을 1ml 천천히 넣어준다.
(세포의 confluency는 70% 정도가 적당하며, 그 이상일 경우 transfection 후 세포가 떨어질 확률이 크다.)
(벽에 흘려보내거나 한방울씩 떨어뜨린다. 최대한 세포가 떨어지지 않게끔 한다.)
7. 37℃·7-8hr incubation 후 fresh media로 change 후37℃·48hr incubation 한다.
(PEI에 의한 세포독성을 줄이기위해 media를 change한다.)
8. media에는 lentivirus가 존재하며 이들을 harvest 하여 15ml tube에 transfer 하여 4℃에 보관한다.
9. fresh media를 다시 넣고37℃·24hr incubation 한다.
10. 8번 과정을 수행 후 centrifuge를 통해 debris를 제거한다.
11. Sup만을 새로운 tube에 transfer 하고, 장기간 보관 시 -80℃에 보관한다.
Lentivirus production
Lentivirus production
- 미지의 단백질을 KO 또는 O/E를 유도하는 viral을 생산하여 세포주에 transduction 시키기 위함. Lentivirus를 만들기 위해 plasmid vector (PLP1, PLP2, VSV-G)가 필요하다. 293FT 세포주를 사용하였으며 PEI를 이용한 transfection을 통해 렌티바이러스를 생산하였다.
1. Sample 당 PLP1, 2 (1.5ug) VSV-G (3ug), target Protein plasmid (2ug)이 필요하다.
2. 각각의 plasmid의 양을 참고하여 EP tube에 넣어주고, Opti-MEM 500ul을 넣어 suspension 한다.
3. Sample 당 PEI 24ul, Opti-MEM 500ul이 필요하다.
4. 각각의 sample 수만큼의 PEI와 Opti-MEM의 양을 계산하여 EP tube에 넣고 suspension 한다.
5. 2번과 4번 과정의 sample을 각각 RT·5min incubation 후 2번과 4번 과정을 mix 하여 RT·20min incubation 한다.
6. 사전에 1.5x10^6 cells/60ø로 seeding 된 293FT 세포에 5번 과정의 sample을 1ml 천천히 넣어준다.
(세포의 confluency는 70% 정도가 적당하며, 그 이상일 경우 transfection 후 세포가 떨어질 확률이 크다.)
(벽에 흘려보내거나 한방울씩 떨어뜨린다. 최대한 세포가 떨어지지 않게끔 한다.)
7. 37℃·7-8hr incubation 후 fresh media로 change 후 37℃·48hr incubation 한다.
(PEI에 의한 세포독성을 줄이기위해 media를 change한다.)
8. media에는 lentivirus가 존재하며 이들을 harvest 하여 15ml tube에 transfer 하여 4℃에 보관한다.
9. fresh media를 다시 넣고 37℃·24hr incubation 한다.
10. 8번 과정을 수행 후 centrifuge를 통해 debris를 제거한다.
11. Sup만을 새로운 tube에 transfer 하고, 장기간 보관 시 -80℃에 보관한다.
*PEI 대신 lipofectamine을 사용하여도 무방하다. (조건은 상이함.)
*freezing과 thawing을 반복할 시 virus titer가 감소할 수 있다.
*세포가 떨어지지 않는 것이 중요하다. incubator로 옮길 때에도 최대한 조심한다.
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